Offene Fragen im Zusammenhang mit dem molekularen Mechanismus
Trotz der Identifikation des mutierten ALK2-Rezeptors als wahrscheinlicher Grund für FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) bestehen verschiedene offene Fragen im Bezug auf den Mechanismus der Fehlaktivierung:
- Wie verändert sich die Interaktion der mutierten GS-Domäne mit anderen Proteinen?
- Welche Komponenten der Signalkaskade sind davon betroffen?
- Können diese Interaktionen in einem Zellkultursystem reproduziert werden?
- Welche Hinweise auf den molekularen Mechanismus der Krankheit können so gefunden werden?
Projektziele
- Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
- Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
- Expression der Proteine in einem Zellsystem
- Aufreinigung der involvierten Proteinkomplexe und -netzwerke
- Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
- Diese stellen möglicherweise Ansatzpunkte zur Heilung der Krankheit dar
- Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen
Analyse von Interaktionen zwischen Komponenten der zellulären
Signalkaskaden –>Verständnis der Signalnetzwerke und deren Veränderungen bei Krankheiten.
Rual et al. (2005) Mapping of the human interactome
- 7‘200 investigated proteins
- 2‘754 interactions identified
- what happens in the human body?
- what is different in patients?
- how can these differences be treated?
Experimentelles Vorgehen
- Klonierung und Expression der relevanten Proteine in HEK293
- Optimierung der Reinigungsmethodik und Test an HEK293
- Vorversuche zur Aufreinigung und Datenanalyse in HEK293
- Testen von komplexeren Zellmodellen (HUVECs, U2OS und Jurkat)
- Wahl des besten Zellmodells
- Expression und Aufreinigung der Proteinkomplexe
- Analyse der BMP-Signalwege
- Darstellung der krankhaften Änderungen bei FOP
- Weitergabe der Daten
Eingesetzte Methoden
- Herstellung stabiler Zelllinien mittels “Flp-In”-Methode
- CaptiVate Pulldown-Methode zur Analyse intrazellulärer Proteinnetzwerke
- CaptiRec-Methode zur Analyse von Interaktionen zwischen BMP4 und ALK2
- Diverse Kloniermethoden, biochemische Methoden zur Proteinanalyse und bioinformatischer Methoden zur Datenauswertung
Projektziele
- Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
- Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
- Expression der Proteine in HEK293
- Etablierung der Aufreinigungsmethoden für Proteinkomplexe und –netzwerke
- Transfer zu physiologischem Zellsystem
- Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
- Analyse von BMP4-ALK2-Interaktionen mittels LRC
- Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen