Offene Fragen im Zusammenhang mit dem molekularen Mechanismus

Trotz der Identifikation des mutierten ALK2-Rezeptors als wahrscheinlicher Grund für FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) bestehen verschiedene offene Fragen im Bezug auf den Mechanismus der Fehlaktivierung:

  • Wie verändert sich die Interaktion der mutierten GS-Domäne mit anderen Proteinen?
  • Welche Komponenten der Signalkaskade sind davon betroffen?
  • Können diese Interaktionen in einem Zellkultursystem reproduziert werden?
  • Welche Hinweise auf den molekularen Mechanismus der Krankheit können so gefunden werden?

Projektziele

  • Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
  • Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
  • Expression der Proteine in einem Zellsystem
  • Aufreinigung der involvierten Proteinkomplexe und -netzwerke
  • Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
  • Diese stellen möglicherweise Ansatzpunkte zur Heilung der Krankheit dar
  • Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen

fop8

 

 

Analyse von Interaktionen zwischen Komponenten der zellulärenfop9Signalkaskaden –>Verständnis der Signalnetzwerke und deren Veränderungen bei Krankheiten.

 

Picture16

Rual et al. (2005) Mapping of the human interactome

  • 7‘200 investigated proteins
  • 2‘754 interactions identified
  • what happens in the human body?
  • what is different in patients?
  • how can these differences be treated?

Experimentelles Vorgehen

  • Klonierung und Expression der relevanten Proteine in HEK293
  • Optimierung der Reinigungsmethodik und Test an HEK293
  • Vorversuche zur Aufreinigung und Datenanalyse in HEK293
  • Testen von komplexeren Zellmodellen (HUVECs, U2OS und Jurkat)
  • Wahl des besten Zellmodells
  • Expression und Aufreinigung der Proteinkomplexe
  • Analyse der BMP-Signalwege
  • Darstellung der krankhaften Änderungen bei FOP
  • Weitergabe der Daten

Eingesetzte Methoden

  • Herstellung stabiler Zelllinien mittels “Flp-In”-Methode
  • CaptiVate Pulldown-Methode zur Analyse intrazellulärer Proteinnetzwerke
  • CaptiRec-Methode zur Analyse von Interaktionen zwischen BMP4 und ALK2
  • Diverse Kloniermethoden, biochemische Methoden zur Proteinanalyse und bioinformatischer Methoden zur Datenauswertung

 Projektziele

  • Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
  • Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
  • Expression der Proteine in HEK293
  • Etablierung der Aufreinigungsmethoden für Proteinkomplexe und –netzwerke
  • Transfer zu physiologischem Zellsystem
  • Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
  • Analyse von BMP4-ALK2-Interaktionen mittels LRC
  • Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen