Etablierung der optimierten Crosslinking-Methode
- Neben dem optimierten Aufreinigungsprotokoll wurde versucht, eine neue Methode zur Aufreinigung zu etablieren
- Bei dieser Methode werden die Proteinkomplexe zunächst in situ verbunden (Cross-linking), um schwache und transiente Interaktionen sichtbar machen zu können
- Mit Ausnahme des Cross-Linking-Schrittes, welcher am Anfang des Aufreinigungsprotokolls steht, fand die Aufreinigung analog zu dem vorhergehenden Protokoll statt
Die Verwendung des Cross-Linking ergab eine leicht erhöhten Sensitivität bei den Pulldowns
Dennoch wurde die Methode nicht weiterentwickelt, da die Reproduzierbarkeit nicht genügend war
Zusammenfassung: Etablierung der Methode in HEK293 Zellen
- Es wurden 8 Schlüsselproteine aus dem BMP-Signalweg ausgesucht, welche für den Krankheitsmechanismus von FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) relevant sein könnten
- Die entsprechenden 8 Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und in HEK293 Zellen integriert, um stabile Linien zu erzeugen, welche die Schlüsselproteine exprimieren
- Verschiedene Aufreinigungsmethoden wurden getestet und optimiert
- Aufreinigungen wurden mittels der optimierten Methode durchgeführt
- Die erhaltenen Daten wurden mittels Bioinformatik-Methoden analysiert
In HEK293 identifizierte Interaktionsnetzwerke
- Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und Q207DRezeptoren, dargestellt mittels Cytoscape-Software
- Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten
- In der nächsten Abbildung ist das Interaktionsnetzwerk kommentier
