Analyse U2OS-Zellen – fibrodysplasia-ossificans-progressiva

Vorgehen

Um den BMP-Signalweg in U2OS-Zellen zu charakterisieren, wurden Pulldown-Versuche mit dem BMP-Rezeptor ALK2 durchgeführt
Zunächst wurden wiederum die Aufreinigungsbedingungen für ALK2 wild-type und die ALK2 R206H-Mutanten aus U2OS optimiert
Aufreinigungen im Pilotmassstab wurden zuerst mittels Western Blotting analysiert, um die Mengen an aufgereinigtem Zielprotein abschätzen zu können

Pilotversuch mit ALK2 wild-type aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

Pilotversuch mit ALK2 R206H aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

Zusätzlich wurde nochmals die Aktivität des Signalwegs in U2OS nach Stimulation mit BMP4 gemessen
Dabei wurde neben dem Marker p-Smad ein weiterer Marker, p-p38, untersucht

Sodann wurden eine Reihe von vollständigen Aufreinigungen des Signalkomplexes in U2OS durchgeführt, ausgehend von ALK2 wild-type und ALK2 R206H
Hierzu wurde das optimierte CaptiVate Pulldown/MS-Verfahrens eingesetzt
Aufreinigungen wurden im Triplikat durchgeführt
Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

Volcano-Plot des finalen Datensatzes
Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

Volcano-Plot des finalen Datensatzes
Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

Resultate

Der kombinerte Datensatz aller ALK2 wild-type Aufreinigungen ergab sieben Interaktionspartner, welche gegenüber der Kontrolle signifikant waren
Der kombinerte Datensatz aller ALK2 R206H Aufreinigungen hingegen zeigte nur einen signifikanten Interaktionspartner
Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der mutierte Rezeptor in U2OS-Zellen weniger Interaktionen mit intrazellulären Proteinen eingeht, als der wild-type Rezeptor

Die Aufreinigung der beiden ALK2-Rezeptoren wurde auch nach Stimulation der U2OS-Zellen mit BMP4 durchgeführt
Dies sollte zeigen, ob sich die Interaktionsmuster der beiden Rezeptoren nach Stimulation mit BMP4 signifikant verändern
Aufreinigungen wurden ebenfalls im Triplikat durchgeführt
Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

Volcano-Plot des finalen Datensatzes
Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
Signalproteine, welche nach Stimulation signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

Volcano-Plot des finalen Datensatzes
Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

Für ALK2 wild-type zeigt die Stimulation mit BMP4 einen starken Effekt: nach BMP4-Behandlung wurden 15 Interaktoren gefunden
Die Aktivierung mit BMP4 führt also zu einer Interaktion des ALK2-Rezeptors mit 9 neuen Proteinen
Eine Interaktion geht durch die Stimulation verloren
Demgegenüber zeigt die ALK2 R206H Mutante erstaunlicherweise keine Veränderung im Interaktionsmuster: auch nach Stimulation konnte nur ein Interaktionspartner identifiziert werden
Dieser war mit der unstimulierten Probe identisch

Die vier finalen Datensätze werden in der untenstehenden Tabelle verglichen:

Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und R206H Rezeptoren in U2OS-Zellen, dargestellt mittels Cytoscape-Software
Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten

Das ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
Bei den gefunden Interaktoren handelt es sich um Chaperone (Hilfsproteine bei der Faltung), Komponenten des Ubiquitinierungsweges (involviert in Proteindegradation) und Komponenten des ERAD-Signalweges (Rezeptor-Sorting und Abbau)
Nach Stimulation mit BMP4 nimmt die Interaktion mit regulierenden Proteinen zu, mehrere zusätzliche Chaperone und Ubiquitin-Ligasen wurden identifiziert
Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
Die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierte R206H-Mutante hingegen interagiert nicht mit für die Degradation relevanten Proteinen
Das Fehlen von in die Degradation involvierten Interaktoren bei der R206H-Mutante könnte bedeuten, dass diese stabiler als ALK2 wildtype ist und nach Stimulation mit BMP4 länger an der Zelloberfläche bleibt