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Analyse mittles LRC BMP4

Analyse der Interaktionen des BMP4-Liganden mittels LRC

Vorgehen

  • Die Ligand-Receptor Capture (LRC) Technologie erlaubt es, für einen bestimmten Liganden das Spektrum an Zelloberflächenrezeptoren, mit welchen er interagiert, zu bestimmen
  • Zu diesem Zweck wird der Ligand mit einem speziellen Crosslinker modifiziert und dann mit Zielzellen inkubiert, welche die Rezeptoren exprimieren
  • Bindet der Ligand an einen bestimmten Rezeptor, so stabilisiert der Crosslinker diese Interaktion und erlaubt die Identifikation des Rezeptors mittels Massenspektrometrie
  • Dieses Verfahren wurde auf den in FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Liganden BMP4 angewendet, um Zielrezeptoren auf HEK293 Zellen zu identifizieren

Kontrollexperiment zur Aktivitätsbestimmung von BMP4-TriCEPS

  • BMP4-Ligand wurde an den TriCEPS Crosslinker gekoppelt
  • Um zu bestimmen, ob BMP4-TriCEPS detektierbar ist, wurde dieses mittels einer Dot Blot Methode getestet
  • Als Kontrolle diente ein Standard-Ligand, Insulin-TriCEPS
  • Wie unten sichtbar, kann BMP4-TriCEPS detektiert werden und ist somit funktionell

 

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  • Clusteranalyse der LRC-Datensätze
  • Die Datensätze aus dem LRC-Experiment wurden gefiltert und verarbeitet
  • Das Cluster-Diagramm zeigt BMP4-Daten im Triplikat gegen eine negative Kontrolle

 

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Volcano-Plot der identifizierten Rezeptoren

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Resultate

  • Es wurden 7 Rezeptoren identifiziert, welche spezifisch mit BMP4 interagieren
  • Der ALK2-Rezeptor wurde nicht identifiziert
  • Vier der identifizierten Rezeptoren sind in einem funktionellen Netzwerk zu finden, welches die Degradation von Rezeptoren reguliert:
  •      Lysosome membrane protein 2 (SCRB2)
  •      Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1)
  •      Endoplasmin (ENPL)
  •      HYOU1
  • Möglicherweise wurde der ALK2-Rezeptor nicht gefunden, da er nach seiner Aktivierung durch BMP4-Bindung sehr schnell von diesem oder ähnlichen Degradationskomplexen von der Zelloberfläche entfernt und degradiert wird

Offene Fragen

Offene Fragen im Zusammenhang mit dem molekularen Mechanismus

Trotz der Identifikation des mutierten ALK2-Rezeptors als wahrscheinlicher Grund für FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) bestehen verschiedene offene Fragen im Bezug auf den Mechanismus der Fehlaktivierung:

  • Wie verändert sich die Interaktion der mutierten GS-Domäne mit anderen Proteinen?
  • Welche Komponenten der Signalkaskade sind davon betroffen?
  • Können diese Interaktionen in einem Zellkultursystem reproduziert werden?
  • Welche Hinweise auf den molekularen Mechanismus der Krankheit können so gefunden werden?

Projektziele

  • Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
  • Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
  • Expression der Proteine in einem Zellsystem
  • Aufreinigung der involvierten Proteinkomplexe und -netzwerke
  • Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
  • Diese stellen möglicherweise Ansatzpunkte zur Heilung der Krankheit dar
  • Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen

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Analyse von Interaktionen zwischen Komponenten der zellulärenfop9Signalkaskaden –>Verständnis der Signalnetzwerke und deren Veränderungen bei Krankheiten.

 

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Rual et al. (2005) Mapping of the human interactome

  • 7‘200 investigated proteins
  • 2‘754 interactions identified
  • what happens in the human body?
  • what is different in patients?
  • how can these differences be treated?

Experimentelles Vorgehen

  • Klonierung und Expression der relevanten Proteine in HEK293
  • Optimierung der Reinigungsmethodik und Test an HEK293
  • Vorversuche zur Aufreinigung und Datenanalyse in HEK293
  • Testen von komplexeren Zellmodellen (HUVECs, U2OS und Jurkat)
  • Wahl des besten Zellmodells
  • Expression und Aufreinigung der Proteinkomplexe
  • Analyse der BMP-Signalwege
  • Darstellung der krankhaften Änderungen bei FOP
  • Weitergabe der Daten

Eingesetzte Methoden

  • Herstellung stabiler Zelllinien mittels “Flp-In”-Methode
  • CaptiVate Pulldown-Methode zur Analyse intrazellulärer Proteinnetzwerke
  • CaptiRec-Methode zur Analyse von Interaktionen zwischen BMP4 und ALK2
  • Diverse Kloniermethoden, biochemische Methoden zur Proteinanalyse und bioinformatischer Methoden zur Datenauswertung

 Projektziele

  • Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
  • Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
  • Expression der Proteine in HEK293
  • Etablierung der Aufreinigungsmethoden für Proteinkomplexe und –netzwerke
  • Transfer zu physiologischem Zellsystem
  • Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
  • Analyse von BMP4-ALK2-Interaktionen mittels LRC
  • Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen