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Analyse mittles LRC BMP4

Analyse der Interaktionen des BMP4-Liganden mittels LRC

Vorgehen

  • Die Ligand-Receptor Capture (LRC) Technologie erlaubt es, für einen bestimmten Liganden das Spektrum an Zelloberflächenrezeptoren, mit welchen er interagiert, zu bestimmen
  • Zu diesem Zweck wird der Ligand mit einem speziellen Crosslinker modifiziert und dann mit Zielzellen inkubiert, welche die Rezeptoren exprimieren
  • Bindet der Ligand an einen bestimmten Rezeptor, so stabilisiert der Crosslinker diese Interaktion und erlaubt die Identifikation des Rezeptors mittels Massenspektrometrie
  • Dieses Verfahren wurde auf den in FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Liganden BMP4 angewendet, um Zielrezeptoren auf HEK293 Zellen zu identifizieren

Kontrollexperiment zur Aktivitätsbestimmung von BMP4-TriCEPS

  • BMP4-Ligand wurde an den TriCEPS Crosslinker gekoppelt
  • Um zu bestimmen, ob BMP4-TriCEPS detektierbar ist, wurde dieses mittels einer Dot Blot Methode getestet
  • Als Kontrolle diente ein Standard-Ligand, Insulin-TriCEPS
  • Wie unten sichtbar, kann BMP4-TriCEPS detektiert werden und ist somit funktionell

 

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  • Clusteranalyse der LRC-Datensätze
  • Die Datensätze aus dem LRC-Experiment wurden gefiltert und verarbeitet
  • Das Cluster-Diagramm zeigt BMP4-Daten im Triplikat gegen eine negative Kontrolle

 

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Volcano-Plot der identifizierten Rezeptoren

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Resultate

  • Es wurden 7 Rezeptoren identifiziert, welche spezifisch mit BMP4 interagieren
  • Der ALK2-Rezeptor wurde nicht identifiziert
  • Vier der identifizierten Rezeptoren sind in einem funktionellen Netzwerk zu finden, welches die Degradation von Rezeptoren reguliert:
  •      Lysosome membrane protein 2 (SCRB2)
  •      Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1)
  •      Endoplasmin (ENPL)
  •      HYOU1
  • Möglicherweise wurde der ALK2-Rezeptor nicht gefunden, da er nach seiner Aktivierung durch BMP4-Bindung sehr schnell von diesem oder ähnlichen Degradationskomplexen von der Zelloberfläche entfernt und degradiert wird

Resultate mit CaptiVate

Untersuchung des BMP-Signalwegs in HEK293-Zellen

Folgende relevante Proteine wurden für die Analyse ausgewählt, da sie Schlüsselkomponenten in der frühen Signalkaskade von BMP darstellen:

  • ALK2 wildtype receptor
  • ALK2 mutated receptors:
  • R206H (causes FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva))
  • Q207D (constitutive active)
  • K235R (dominant negative)
  • ALK6 wildtype receptor
  • ALK6 mutated receptor (I200K): causes brachydactyl (shortness of the fingers and toes)
  • BMPRII: type II receptor
  • FKBP12

Die Schlüsselproteine sind auf der folgenden Abbildung nochmals im Kontext des Signalwegs gezeigt.

Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine

signalproteine

Konstruktion neuer Expressionsvektoren

Zunächst mussten verschiedene Vektoren hergestellt werden, um die verschiedenen Schlüsselproteine exprimieren zu können.

Untenstehend ist der Basis-Vektor gezeigt. Es handelt sich um einen eukaryotischen Expressionsvektor, welcher folgende Komponenten trägt:

  • Strep II und HA Epitop-Tags zur Aufreinigung und Detektion der Schlüsselproteine
  • Induzierbarer Promoter zur regulierten Expression
  • Verschiedene Selektionsmarker zur Erzeugung stabiler Zelllinien

Konstruktion 32

Konstruktion eines neuen Expressionsvektors für ALK2

Zusätzlich wurde ein spezieller Expressionsvektor für die Expression der BMP-Rezeptoren konstruiert.

Dies ist notwendig, da die BMP-Rezeptoren N-terminal ein spezielles Element tragen, welches bei der Expression aus konventionellen Vektoren verloren gehen würde. Der modifizierte Expressionvektor sorgt für die korrekte Expression dieses Elements.

Konstroktioin 33

Klonierung der Konstrukte

Anschliessend wurden die untenstehenden Konstrukte generiert, indem die für die Schlüsselproteine kodierenden Gene in die Expressionsvektoren kloniert wurden:

Klonierung 34

Transfektion und Etablierung stabiler HEK293-Linien

  • HEK293-Zellen wurden mittels der Calciumphosphat-Methode transfektiert
  • Die folgenden Konstrukte wurde hierfür eingesetzt:
  • ALK2wt (wildtyp)
  • ALK2 Q207D
  • ALK2 K236R
  • ALK2 R206H
  • Mittels Selektion wurden stabile Linien erzeugt, welche die Proteine exprimieren
  • Der Nachweis der Expression erfolgte mittels Proteinextraktion aus den Zellen, gefolgt von Auftrennung mittels SDS-PAGE und Western Blotting mit einem antiHA-Antikörper
  • Anschliessend wurde das Extraktions-/Aufreinigungsprotokoll optimiert, um die Sensitivität zu optimieren

Etablierung der HEK293-Linien und Optimierung der Aufreinigung

  • Generierung von 8 Zelllinien, welche die Schlüsselproteine exprimieren
  • Optimierung der Aufreinigung, um möglichst viele Interaktionen sichtbar zu machen

 

Etablierung 36

Etablierung der HEK293-Linien und Optimierung der Aufreinigung

Etablierung 37

 

Etablierung der HEK293-Linien und Optimierung der AufreinigungEtablierung 38

Test der Funktionalität des Signalwegs

  • Die Aktivität des BMP-Signalwegs kann mittels eines «Indikator-Proteins» getestet werden
  • Der ALK2-Rezeptor hat eine intrazelluläre Kinase-Domäne
  • Wird ALK2 durch Stimulation mit dem Liganden BMP4 aktiviert, so wird die Kinase-Domäne aktiv und modifiziert das Signalprotein Smad
  • Die Aktivierung erfolgt via Modifikation mit einem Phosphat-Rest (Phosphorylierung)
  • Die Phosphorylierung von Smad kann mittels Western Blotting mit einem anti P-Smad Antikörper nachgewiesen werden

Resultate
Die Schlüsselproteine sind exprimiert
Der Signalweg kann stimuliert werden und die Phosphorylierung von Smad 1, 5 und 8 ist detektierbar

Funktionalität 40

Aufreinigung und Identifikation der Proteinkomplexe

  • Die Proteinkomplexe aus den stabilen HEK293-Linien wurden mittels des optimierten CaptiVate Pulldown/MS-Verfahrens aufgereinigt
  • Für jede Linie wurden zunächst mehrere Pilot-Aufreinigungen durchgeführt und getestet
  • Sodann wurden Aufreinigungen im Triplikat mit grossen Zellmengen durchgeführt
  • Die Zellen wurden aufgebrochen und die Proteine extrahiert
  • Die Aufreinigung geschah mittels eines Strep-Säulenmaterials
  • Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
  • Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
  • Ergebnis ist eine Liste von Interaktoren des Bait-Proteins

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Zusammenfassung der in Hek293-Zellen durchgeführten Pulldown-Experimente

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Resultate

  • Für ALK2 wildtype konnten mehrere Interaktoren identifiziert werden
  • Für die ALK2-Mutante Q207D wurden ebenfalls Interaktoren gefunden, welche stark mit den für ALK2 wildtype gefundenen Interaktoren überlappen
  • Zusätzlich wurden für ALK2 Q207D weitere Interaktoren identifiziert, während für ALK2 R206H und ALK2 K236R keine Interaktoren gefunden wurden
  • Der BMPRII Rezeptor lieferte ebenfalls keine Interaktoren, was an der sehr schwachen Expression des Rezeptors liegen könnte
  • Für das Modulator-Protein FKBP12 konnte ein Interaktor identifiziert werden, ebenfalls wurde FKBP12 als Interaktor von ALK2 wildtype gefunden
  • Pulldowns mit den beiden ALK6-Rezeptoren lieferten keine Interaktoren
  • Die mit den ALK2-Rezeptoren und FKBP12 identifizierten Interaktoren erlauben die Abbildung des Rezeptor-proximalen Signalweges, sowie der Sorting- und Degradationsmaschinerie, welche den Abbau des ALK2-Rezeptors steuert

 

Etablierung

Etablierung der optimierten Crosslinking-Methode

  • Neben dem optimierten Aufreinigungsprotokoll wurde versucht, eine neue Methode zur Aufreinigung zu etablieren
  • Bei dieser Methode werden die Proteinkomplexe zunächst in situ verbunden (Cross-linking), um schwache und transiente Interaktionen sichtbar machen zu können
  • Mit Ausnahme des Cross-Linking-Schrittes, welcher am Anfang des Aufreinigungsprotokolls steht, fand die Aufreinigung analog zu dem vorhergehenden Protokoll statt

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Die Verwendung des Cross-Linking ergab eine leicht erhöhten Sensitivität bei den Pulldowns
Dennoch wurde die Methode nicht weiterentwickelt, da die Reproduzierbarkeit nicht genügend war

Zusammenfassung: Etablierung der Methode in HEK293 Zellen

  • Es wurden 8 Schlüsselproteine aus dem BMP-Signalweg ausgesucht, welche für den Krankheitsmechanismus von FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) relevant sein könnten
  • Die entsprechenden 8 Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und in HEK293 Zellen integriert, um stabile Linien zu erzeugen, welche die Schlüsselproteine exprimieren
  • Verschiedene Aufreinigungsmethoden wurden getestet und optimiert
  • Aufreinigungen wurden mittels der optimierten Methode durchgeführt
  • Die erhaltenen Daten wurden mittels Bioinformatik-Methoden analysiert

In HEK293 identifizierte Interaktionsnetzwerke

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  • Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und Q207DRezeptoren, dargestellt mittels Cytoscape-Software
  • Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten
  • In der nächsten Abbildung ist das Interaktionsnetzwerk kommentier

 

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