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Analyse mittles LRC BMP4

Analyse der Interaktionen des BMP4-Liganden mittels LRC

Vorgehen

  • Die Ligand-Receptor Capture (LRC) Technologie erlaubt es, für einen bestimmten Liganden das Spektrum an Zelloberflächenrezeptoren, mit welchen er interagiert, zu bestimmen
  • Zu diesem Zweck wird der Ligand mit einem speziellen Crosslinker modifiziert und dann mit Zielzellen inkubiert, welche die Rezeptoren exprimieren
  • Bindet der Ligand an einen bestimmten Rezeptor, so stabilisiert der Crosslinker diese Interaktion und erlaubt die Identifikation des Rezeptors mittels Massenspektrometrie
  • Dieses Verfahren wurde auf den in FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Liganden BMP4 angewendet, um Zielrezeptoren auf HEK293 Zellen zu identifizieren

Kontrollexperiment zur Aktivitätsbestimmung von BMP4-TriCEPS

  • BMP4-Ligand wurde an den TriCEPS Crosslinker gekoppelt
  • Um zu bestimmen, ob BMP4-TriCEPS detektierbar ist, wurde dieses mittels einer Dot Blot Methode getestet
  • Als Kontrolle diente ein Standard-Ligand, Insulin-TriCEPS
  • Wie unten sichtbar, kann BMP4-TriCEPS detektiert werden und ist somit funktionell

 

analyse98

  • Clusteranalyse der LRC-Datensätze
  • Die Datensätze aus dem LRC-Experiment wurden gefiltert und verarbeitet
  • Das Cluster-Diagramm zeigt BMP4-Daten im Triplikat gegen eine negative Kontrolle

 

analyse99

Volcano-Plot der identifizierten Rezeptoren

analyse100

Resultate

  • Es wurden 7 Rezeptoren identifiziert, welche spezifisch mit BMP4 interagieren
  • Der ALK2-Rezeptor wurde nicht identifiziert
  • Vier der identifizierten Rezeptoren sind in einem funktionellen Netzwerk zu finden, welches die Degradation von Rezeptoren reguliert:
  •      Lysosome membrane protein 2 (SCRB2)
  •      Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1)
  •      Endoplasmin (ENPL)
  •      HYOU1
  • Möglicherweise wurde der ALK2-Rezeptor nicht gefunden, da er nach seiner Aktivierung durch BMP4-Bindung sehr schnell von diesem oder ähnlichen Degradationskomplexen von der Zelloberfläche entfernt und degradiert wird

Analyse U2OS-Zellen

Analyse des BMP-Signalwegs in U2OS-Zellen

Vorgehen

  • Um den BMP-Signalweg in U2OS-Zellen zu charakterisieren, wurden Pulldown-Versuche mit dem BMP-Rezeptor ALK2 durchgeführt
  • Zunächst wurden wiederum die Aufreinigungsbedingungen für ALK2 wild-type und die ALK2 R206H-Mutanten aus U2OS optimiert
  • Aufreinigungen im Pilotmassstab wurden zuerst mittels Western Blotting analysiert, um die Mengen an aufgereinigtem Zielprotein abschätzen zu können
  • Pilotversuch mit ALK2 wild-type aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
  • Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

 

zellen U2OS

  • Pilotversuch mit ALK2 R206H aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
  • Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

zellen U2OS-69 zellen U2OS-68png

  • Zusätzlich wurde nochmals die Aktivität des Signalwegs in U2OS nach Stimulation mit BMP4 gemessen
  • Dabei wurde neben dem Marker p-Smad ein weiterer Marker, p-p38, untersucht

 

zellen U2OS-69

Aufreinigung und Identifikation der Proteinkomplexe aus U2OS

  • Sodann wurden eine Reihe von vollständigen Aufreinigungen des Signalkomplexes in U2OS durchgeführt, ausgehend von ALK2 wild-type und ALK2 R206H
  • Hierzu wurde das optimierte CaptiVate Pulldown/MS-Verfahrens eingesetzt
  • Aufreinigungen wurden im Triplikat durchgeführt
  • Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
  • Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
  • Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Aufreinigung und Analyse von ALK2 wild-type aus U2OS

  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

aufreinigung71

Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 wild-type

  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

aufreinigung72

  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

aufreinigung 73

  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

aufreinigung 74

 

  • Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 R206H
  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

aufreinigung 75

  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

aufreinigung 76

Resultate

  • Der kombinerte Datensatz aller ALK2 wild-type Aufreinigungen ergab sieben Interaktionspartner, welche gegenüber der Kontrolle signifikant waren
  • Der kombinerte Datensatz aller ALK2 R206H Aufreinigungen hingegen zeigte nur einen signifikanten Interaktionspartner
  • Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der mutierte Rezeptor in U2OS-Zellen weniger Interaktionen mit intrazellulären Proteinen eingeht, als der wild-type Rezeptor

Aufreinigung der Proteinkomplexe aus U2OS nach BMP4-Stimulation

  • Die Aufreinigung der beiden ALK2-Rezeptoren wurde auch nach Stimulation der U2OS-Zellen mit BMP4 durchgeführt
  • Dies sollte zeigen, ob sich die Interaktionsmuster der beiden Rezeptoren nach Stimulation mit BMP4 signifikant verändern
  • Aufreinigungen wurden ebenfalls im Triplikat durchgeführt
  • Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
  • Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
  • Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Aufreinigung und Analyse von ALK2 wild-type aus stimulierten U2OS

  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

aufreinigung 79

  • Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 wild-type
  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

aufreinigung 80

  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche nach Stimulation signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

 

aufreinigung 81

  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

aufreinigung 82

  • Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 R206H
  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

 

aufreinigung 83

  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

aufreinigung 84

 

Aufreinigung der Proteinkomplexe aus  stimuliertenU2OS

Resultate

  • Für ALK2 wild-type zeigt die Stimulation mit BMP4 einen starken Effekt: nach BMP4-Behandlung wurden 15 Interaktoren gefunden
  • Die Aktivierung mit BMP4 führt also zu einer Interaktion des ALK2-Rezeptors mit 9 neuen Proteinen
  • Eine Interaktion geht durch die Stimulation verloren
  • Demgegenüber zeigt die ALK2 R206H Mutante erstaunlicherweise keine Veränderung im Interaktionsmuster: auch nach Stimulation konnte nur ein Interaktionspartner identifiziert werden
  • Dieser war mit der unstimulierten Probe identisch

Vergleich der Interaktionsdaten

Die vier finalen Datensätze werden in der untenstehenden Tabelle verglichen:

vergleich 86

In U2OS identifizierte Interaktionsnetzwerke

u2os87 U2OS-87

  • Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und R206H Rezeptoren in U2OS-Zellen, dargestellt mittels Cytoscape-Software
  • Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten

Zusammenfassung: ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen

  • Das ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
  • Bei den gefunden Interaktoren handelt es sich um Chaperone (Hilfsproteine bei der Faltung), Komponenten des Ubiquitinierungsweges (involviert in Proteindegradation) und Komponenten des ERAD-Signalweges (Rezeptor-Sorting und Abbau)
  • Nach Stimulation mit BMP4 nimmt die Interaktion mit regulierenden Proteinen zu, mehrere zusätzliche Chaperone und Ubiquitin-Ligasen wurden identifiziert
  • Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
  • Die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierte R206H-Mutante hingegen interagiert nicht mit für die Degradation relevanten Proteinen
  • Das Fehlen von in die Degradation involvierten Interaktoren bei der R206H-Mutante könnte bedeuten, dass diese stabiler als ALK2 wildtype ist und nach Stimulation mit BMP4 länger an der Zelloberfläche bleibt

Resultate mit CaptiVate

Untersuchung des BMP-Signalwegs in HEK293-Zellen

Folgende relevante Proteine wurden für die Analyse ausgewählt, da sie Schlüsselkomponenten in der frühen Signalkaskade von BMP darstellen:

  • ALK2 wildtype receptor
  • ALK2 mutated receptors:
  • R206H (causes FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva))
  • Q207D (constitutive active)
  • K235R (dominant negative)
  • ALK6 wildtype receptor
  • ALK6 mutated receptor (I200K): causes brachydactyl (shortness of the fingers and toes)
  • BMPRII: type II receptor
  • FKBP12

Die Schlüsselproteine sind auf der folgenden Abbildung nochmals im Kontext des Signalwegs gezeigt.

Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine

signalproteine

Konstruktion neuer Expressionsvektoren

Zunächst mussten verschiedene Vektoren hergestellt werden, um die verschiedenen Schlüsselproteine exprimieren zu können.

Untenstehend ist der Basis-Vektor gezeigt. Es handelt sich um einen eukaryotischen Expressionsvektor, welcher folgende Komponenten trägt:

  • Strep II und HA Epitop-Tags zur Aufreinigung und Detektion der Schlüsselproteine
  • Induzierbarer Promoter zur regulierten Expression
  • Verschiedene Selektionsmarker zur Erzeugung stabiler Zelllinien

Konstruktion 32

Konstruktion eines neuen Expressionsvektors für ALK2

Zusätzlich wurde ein spezieller Expressionsvektor für die Expression der BMP-Rezeptoren konstruiert.

Dies ist notwendig, da die BMP-Rezeptoren N-terminal ein spezielles Element tragen, welches bei der Expression aus konventionellen Vektoren verloren gehen würde. Der modifizierte Expressionvektor sorgt für die korrekte Expression dieses Elements.

Konstroktioin 33

Klonierung der Konstrukte

Anschliessend wurden die untenstehenden Konstrukte generiert, indem die für die Schlüsselproteine kodierenden Gene in die Expressionsvektoren kloniert wurden:

Klonierung 34

Transfektion und Etablierung stabiler HEK293-Linien

  • HEK293-Zellen wurden mittels der Calciumphosphat-Methode transfektiert
  • Die folgenden Konstrukte wurde hierfür eingesetzt:
  • ALK2wt (wildtyp)
  • ALK2 Q207D
  • ALK2 K236R
  • ALK2 R206H
  • Mittels Selektion wurden stabile Linien erzeugt, welche die Proteine exprimieren
  • Der Nachweis der Expression erfolgte mittels Proteinextraktion aus den Zellen, gefolgt von Auftrennung mittels SDS-PAGE und Western Blotting mit einem antiHA-Antikörper
  • Anschliessend wurde das Extraktions-/Aufreinigungsprotokoll optimiert, um die Sensitivität zu optimieren

Etablierung der HEK293-Linien und Optimierung der Aufreinigung

  • Generierung von 8 Zelllinien, welche die Schlüsselproteine exprimieren
  • Optimierung der Aufreinigung, um möglichst viele Interaktionen sichtbar zu machen

 

Etablierung 36

Etablierung der HEK293-Linien und Optimierung der Aufreinigung

Etablierung 37

 

Etablierung der HEK293-Linien und Optimierung der AufreinigungEtablierung 38

Test der Funktionalität des Signalwegs

  • Die Aktivität des BMP-Signalwegs kann mittels eines «Indikator-Proteins» getestet werden
  • Der ALK2-Rezeptor hat eine intrazelluläre Kinase-Domäne
  • Wird ALK2 durch Stimulation mit dem Liganden BMP4 aktiviert, so wird die Kinase-Domäne aktiv und modifiziert das Signalprotein Smad
  • Die Aktivierung erfolgt via Modifikation mit einem Phosphat-Rest (Phosphorylierung)
  • Die Phosphorylierung von Smad kann mittels Western Blotting mit einem anti P-Smad Antikörper nachgewiesen werden

Resultate
Die Schlüsselproteine sind exprimiert
Der Signalweg kann stimuliert werden und die Phosphorylierung von Smad 1, 5 und 8 ist detektierbar

Funktionalität 40

Aufreinigung und Identifikation der Proteinkomplexe

  • Die Proteinkomplexe aus den stabilen HEK293-Linien wurden mittels des optimierten CaptiVate Pulldown/MS-Verfahrens aufgereinigt
  • Für jede Linie wurden zunächst mehrere Pilot-Aufreinigungen durchgeführt und getestet
  • Sodann wurden Aufreinigungen im Triplikat mit grossen Zellmengen durchgeführt
  • Die Zellen wurden aufgebrochen und die Proteine extrahiert
  • Die Aufreinigung geschah mittels eines Strep-Säulenmaterials
  • Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
  • Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
  • Ergebnis ist eine Liste von Interaktoren des Bait-Proteins

Aufreinigung42

Zusammenfassung der in Hek293-Zellen durchgeführten Pulldown-Experimente

Aufreinigung43

Resultate

  • Für ALK2 wildtype konnten mehrere Interaktoren identifiziert werden
  • Für die ALK2-Mutante Q207D wurden ebenfalls Interaktoren gefunden, welche stark mit den für ALK2 wildtype gefundenen Interaktoren überlappen
  • Zusätzlich wurden für ALK2 Q207D weitere Interaktoren identifiziert, während für ALK2 R206H und ALK2 K236R keine Interaktoren gefunden wurden
  • Der BMPRII Rezeptor lieferte ebenfalls keine Interaktoren, was an der sehr schwachen Expression des Rezeptors liegen könnte
  • Für das Modulator-Protein FKBP12 konnte ein Interaktor identifiziert werden, ebenfalls wurde FKBP12 als Interaktor von ALK2 wildtype gefunden
  • Pulldowns mit den beiden ALK6-Rezeptoren lieferten keine Interaktoren
  • Die mit den ALK2-Rezeptoren und FKBP12 identifizierten Interaktoren erlauben die Abbildung des Rezeptor-proximalen Signalweges, sowie der Sorting- und Degradationsmaschinerie, welche den Abbau des ALK2-Rezeptors steuert

 

Diskussion

Bedeutung der gefundenen Interaktoren von ALK2

diskussion103

Diskussion: das intrazelluläre Netzwerk von ALK2

  • Das Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
  • Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
  • Dies wird auch durch die Beobachtung unterstützt, dass nach Stimulation mit BMP4 mehrere in die Degradation involvierte Proteine an ALK2 binden, welche nicht an dem unstimulierten Rezeptor gefunden wurden
  • Dem gegenüber zeigt die bei FOP involvierte R206H-Mutante ein stark reduziertes Interaktionsspektrum, es wurden keine in die Degradation involvierten Interaktoren identifiziert
  • Möglicherweise interagiert die R206H-Mutante nur noch schwach mit den Proteinen der Degradationsmaschinerie, was wiederum Auswirkungen auf die Menge an ALK2-Rezeptor und dessen Präsenz an der Zelloberfläche haben könnte
  • Sollte die ALK2-Mutante an der Zelloberfläche akkumulieren, so könnte dies eine Rolle bei der in FOP beobachteten Überaktivität von ALK2 spielen

diskussion105

 

 

fop-106

FOP-Projekt: Erkenntnisse und Publikation der Daten

  • Das Projekt, die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Signalwege und Interaktionsnetzwerke zu untersuchen, wurde erfolgreich abgeschlossen
  • Dabei wurden Hinweise auf einen möglichen Krankheitsmechanismus gefunden, welcher zur Akkumulation des mutierten ALK2-Rezeptors an der Oberfläche der Zellen führen könnte
  • Dies könnte neue Ansätze zur Manipulation der Krankheit ergeben, in dem Faktoren gesucht werden, welche diese Akkumulation unterbinden könnten
  • Die experimentellen Daten werden nun vollständig interessierten Forschern zur Verfügung gestellt
  • Dies geschieht über direkten Kontakt zu relevanten Gruppen (z.B. Gruppe Kaplan) und Publikation auf der Website oder in Fachjournalen

Resultate Zellmodellen

Testen von komplexeren Zellmodellen

In einem nächsten Schritt wurde ein Zellmodell gesucht, welches physiologisch noch näher bei der in vivo-Situation von FOP liegt.

  • Zu diesem Zweck wurden 3 verschiedene Zellmodelle getestet:
  • HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells)
  • U2OS (human osteosarcoma cells)
  • Jurkat (immortalized T lymphocytes)

Alle 3 Modelle sind relevant für die entzündlichen Reaktionen und Differenzierung zu Knochen, welche in FOP stattfindet.

Die Modelle werden auf folgende Parameter getestet:

  • Kultivierbarkeit
  • BMP-Signalweg aktiv und stimulierbar mit BMP4
  • Transfektionseffizienz (Einbringen der Konstrukte, welche für die Zielproteine kodieren)

Kultivierung von HUVEC, U2OS und Jurkat

Nachfolgend sind die Eigenschaften der drei Zelllinien zusammengefasst:

1. HUVEC (Human umbilical vein endothelial) cells

HUVECs werden aus normaler menschlicher Nabelschnur isoliert. Es handelt sich um Primärzellen, welche nach der Isolation eingefroren werden und nach dem Auftauen durch ca. 16 Passagen expandiert werden können.
HUVECs werden oft für physiologische und pharmakologische Studien verwendet, wie etwa Untersuchungen zum Transport von Makromolekülen, Blutgerinnung oder Fibrinolyse. HUVECs exprimieren Komponenten des BMP-Signalwegs und sind deshalb auch zum Studium von FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) geeignet.

Kultivierung 53

HUVEC-Zellen in Kultur

2. U2OS (human osteosarcoma) cells

U2OS ist eine humane Osteosarcoma-Linie, welche 1964 aus einem moderat differenziertem Sarkom des Schienbeinknochens etabliert wurden. U2OS exprimieren ebenfalls Komponenten des BMP-Signalweges und können mit BMP4 stimuliert werden

Kultivierung 54

U2OS-Zellen in Kultur

2. Jurkat cells (immortalized human T lymphocytes)

Jurkat sind immortalisierte humane T-Lymphozyten, welche 1970 aus peripherem Blut eines Leukämie-Patienten etabliert wurden.
Jurkat Zellen werden häufig für Virusstudien und im Zusammenhang mit molekularen Mechanismen bei der Entstehung von Krebs eingesetzt und exprimieren eine Reihe von Chemokin-Rezeptoren, ebenso wie BMP-Rezeptoren.
Im Gegensatz zu HUVEC- und U2OS-Zellen sind Jurkat-Zellen nicht adhärent, sondern werden in Suspension kultiviert.

Jurkat-Zellen in Kultur

Jurkat-Zellen in Kultur

Voruntersuchungen an HUVEC, U2OS und Jurkat Zellen

Alle drei Zellmodelle werden zunächst auf folgende Parameter getestet:

  • Kultivierbarkeit
  • BMP-Signalweg aktiv und stimulierbar mit BMP4
  • Transfektionseffizienz (Einbringen der Konstrukte, welche für die Zielproteine kodieren)

Dabei zeigten sich relativ rasch zwei Schwierigkeiten:

  • HUVECs waren schwer kultivierbar, mit geringen Ausbeuten und langsamen Wachstumsraten
  • Jurkat-Zellen waren trotz der Anwendung verschiedener Protokolle nicht mit einer ausreichenden, reproduzierbaren Effizienz transfektierbar
  • Da die Transfektion zur Einbringung der Schlüsselproteine eine Grundvoraussetzung darstellt, wurde die Jurkat-Zellen ausgeschlossen

Test der Funktionalität des Signalwegs

 Stimulation des BMP-Signalwegs

Im Anschluss wurde an HUVEC und U2OS gestestet, ob der BMP-Signalweg mit BMP4 stimuliert werden konnte
Dazu wurden die Zellen für 30 min. mit BMP4 stimuliert und jeweils bei 0, 10 und 30 min. Proben genommen
Aktivierung des Signalwegs wurde wiederum mittels Western Blotting mit einem anti P-Smad Antikörper nachgewiesen

Test der Funktionalität des Signalwegs in HUVEC

  • Die HUVECs zeigen eine Antwort auf BMP4-Stimulation
  • Daraus kann geschlossen werden, dass der BMP-Signalweg aktiv ist

Funktonalität 58

  • Die Aktivierung des Signalwegs in U2OS ergibt ebenfalls eine korrekte Stimulation
  • Die Stimulation ist weniger stark, als in Alk2-exprimierenden HEK293, was eher der Situation im Menschen entspricht

Funktionalität 59

Resultate

  • HUVECs zeigten eine starke Antwort auf BMP4-Stimulation, welche bereits nach ca. 10 min. sichtbar war
  • Die Antwort auf BMP4-Stimulation war bei U2OS-Zellen ebenfalls detektierbar, aber deutlich schwächer als in HUVECs

Test der Transfektionseffizienz

  • Um eine genügende Expression der Schlüsselproteine zu gewährleisten, muss die Effizienz der Einbringung der DNA-Konstrukte (Transfektionseffizienz) genügend hoch sein
  • Die Transfektion der 3 Zelllinien wurde mit verschiedenen Methoden getestet
  • Für jede Methode wurden verschiedene Parameter einzeln optimiert
  • Die Effizienz der Transfektion wurde mittels Western Blotting mit einem anti HA Antikörper gemessen, welcher direkt das eingebrachte Protein detektiert
  • Effizienz und Reproduzierbarkeit wurden auch mittels Pilot-Pulldowns und Massenspektrometrie-Analyse gemessen
  • Im Anschluss wird exemplarisch ein Beispiel für die HUVEC-Zellen gezeigt

HUVEC Transfektionseffizienz

Transfektionen von HUVECs mit dem ALK2-wt Konstrukt mittels Calciumphosphat- und Lipofectamine-Methode. Die Detektion erfolgte mittels eines Antikörpers gegen den HA-tag, welcher C-terminal an ALK2 fusioniert ist.

  • Zwei Methoden wurden verwendet:
  • Calciumphosphat-Methode (CT)
  • Lipofectamine-Methode (LTX)

HUVEC62

  • HUVEC sind transfektierbar mit Lipofectamine
  • Die erste Expression des eingebrachten Proteins ist nach ca. 9 Stunden sichtbar
  • Die Transfektion mit der Calciumphosphat-Methode zeigt keine detektierbare Expression

HUVEC63

  • HUVEC sind transfektierbar
  • Die Reproduzierbarkeit der Transfektionen ist innerhalb der Vorgaben
  • Die Transfektionseffizienz ist aber ungenügend

Resultate

  • Die Transfektion von Jurkat-Zellen zeigte weder eine genügende Transfektionseffizienz, noch eine genügend hohe Reproduzierbarkeit zwischen den einzelnen Transfektionen
  • Die Transfektion von HUVEC-Zellen mittels Lipofectamine war reproduzierbar, allerdings war die Transfektionseffizienz ungenügend
  • Einzig die U2OS-Zellen zeigten eine genügende Transfektionseffizienz, kombiniert mit einer guten Reproduzierbarkeit
  • Aus diesem Grund wurde entschieden, die weiteren Versuche mit U2OS-Zellen durchzuführen

 

Etablierung

Etablierung der optimierten Crosslinking-Methode

  • Neben dem optimierten Aufreinigungsprotokoll wurde versucht, eine neue Methode zur Aufreinigung zu etablieren
  • Bei dieser Methode werden die Proteinkomplexe zunächst in situ verbunden (Cross-linking), um schwache und transiente Interaktionen sichtbar machen zu können
  • Mit Ausnahme des Cross-Linking-Schrittes, welcher am Anfang des Aufreinigungsprotokolls steht, fand die Aufreinigung analog zu dem vorhergehenden Protokoll statt

Etablierung 46

Die Verwendung des Cross-Linking ergab eine leicht erhöhten Sensitivität bei den Pulldowns
Dennoch wurde die Methode nicht weiterentwickelt, da die Reproduzierbarkeit nicht genügend war

Zusammenfassung: Etablierung der Methode in HEK293 Zellen

  • Es wurden 8 Schlüsselproteine aus dem BMP-Signalweg ausgesucht, welche für den Krankheitsmechanismus von FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) relevant sein könnten
  • Die entsprechenden 8 Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und in HEK293 Zellen integriert, um stabile Linien zu erzeugen, welche die Schlüsselproteine exprimieren
  • Verschiedene Aufreinigungsmethoden wurden getestet und optimiert
  • Aufreinigungen wurden mittels der optimierten Methode durchgeführt
  • Die erhaltenen Daten wurden mittels Bioinformatik-Methoden analysiert

In HEK293 identifizierte Interaktionsnetzwerke

HEK293 49

  • Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und Q207DRezeptoren, dargestellt mittels Cytoscape-Software
  • Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten
  • In der nächsten Abbildung ist das Interaktionsnetzwerk kommentier

 

interaktion50

Untersuchung mit CaptiVate

Untersuchung des BMP-Signalweges mittels CaptiVate

CaptiVate Aufreinigungsverfahren zur Analyse des Signalwegs

CaptiVate™ Plattform: Beschreibung des Workflows

Picture12

  • Verwendung des Flp-In-Systems zur stabilen Expression
  • Induzierbarer Promoter erlaubt regulierbare Expression

 Teil I: Erstellung der stabilen Zelllinie

  • Verwendung des Flp-In-Systems zur stabilen Expression
  • Induzierbarer Promoter erlaubt regulierbare Expression

 

Zelllinie

 

Teil II: Affinitätsreinigung des „Bait“-Komplexes

komplex

Teil III: LC-MS/M-Analyse, bioinformatische Auswertung

auswertung

 

CaptiVate™ Plattform: Vorteile

vorteile

 

  • Physiologisch: Expression der “Bait” von einem integrierten Transgen erlaubt physiologische Expressionsmengen
  • Reproduzierbar: alle Aufreinigungen werden im Triplikat durchgeführt (85% Reproduzierbarkeit)
  • Sensitiv: es werden nur 3×106 Zellen pro Aufreinigung benötigt
  • Spezifisch: bioinformatische Nachbearbeitung entfernt unspezifischen Hintergrund

Offene Fragen

Offene Fragen im Zusammenhang mit dem molekularen Mechanismus

Trotz der Identifikation des mutierten ALK2-Rezeptors als wahrscheinlicher Grund für FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) bestehen verschiedene offene Fragen im Bezug auf den Mechanismus der Fehlaktivierung:

  • Wie verändert sich die Interaktion der mutierten GS-Domäne mit anderen Proteinen?
  • Welche Komponenten der Signalkaskade sind davon betroffen?
  • Können diese Interaktionen in einem Zellkultursystem reproduziert werden?
  • Welche Hinweise auf den molekularen Mechanismus der Krankheit können so gefunden werden?

Projektziele

  • Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
  • Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
  • Expression der Proteine in einem Zellsystem
  • Aufreinigung der involvierten Proteinkomplexe und -netzwerke
  • Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
  • Diese stellen möglicherweise Ansatzpunkte zur Heilung der Krankheit dar
  • Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen

fop8

 

 

Analyse von Interaktionen zwischen Komponenten der zellulärenfop9Signalkaskaden –>Verständnis der Signalnetzwerke und deren Veränderungen bei Krankheiten.

 

Picture16

Rual et al. (2005) Mapping of the human interactome

  • 7‘200 investigated proteins
  • 2‘754 interactions identified
  • what happens in the human body?
  • what is different in patients?
  • how can these differences be treated?

Experimentelles Vorgehen

  • Klonierung und Expression der relevanten Proteine in HEK293
  • Optimierung der Reinigungsmethodik und Test an HEK293
  • Vorversuche zur Aufreinigung und Datenanalyse in HEK293
  • Testen von komplexeren Zellmodellen (HUVECs, U2OS und Jurkat)
  • Wahl des besten Zellmodells
  • Expression und Aufreinigung der Proteinkomplexe
  • Analyse der BMP-Signalwege
  • Darstellung der krankhaften Änderungen bei FOP
  • Weitergabe der Daten

Eingesetzte Methoden

  • Herstellung stabiler Zelllinien mittels “Flp-In”-Methode
  • CaptiVate Pulldown-Methode zur Analyse intrazellulärer Proteinnetzwerke
  • CaptiRec-Methode zur Analyse von Interaktionen zwischen BMP4 und ALK2
  • Diverse Kloniermethoden, biochemische Methoden zur Proteinanalyse und bioinformatischer Methoden zur Datenauswertung

 Projektziele

  • Identifikation der BMP-Rezeptoren und Signalproteine, welche zur Untersuchung kloniert werden sollen
  • Klonierung der entsprechenden Gene in Expressionsvektoren
  • Expression der Proteine in HEK293
  • Etablierung der Aufreinigungsmethoden für Proteinkomplexe und –netzwerke
  • Transfer zu physiologischem Zellsystem
  • Identifikation von FOP-spezifischen Änderungen in den Signalwegen
  • Analyse von BMP4-ALK2-Interaktionen mittels LRC
  • Weitergabe aller Daten an interessierte Forscher, entweder direkt oder via Publikationen

 

Krankheitsmechanismus

Erste Belege für eine Rolle des BMP-Signalwegs in FOP

  • 2006 konnte durch eine sogennante “Genome Linkage Analysis” an FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva)-betroffenen Familien gezeigt werden, dass eine Punktmutation in einem Zelloberflächenrezeptor bei FOP eine Rolle spielt (Shore et al., 2006)
  • Der identifizierte Zelloberflächenrezeptor, ACVR1/ALK2, gehört zur Familie der Typ I Bone Morphogenetic Protein (BMP) Rezeptoren
  • BMP und seine Rezeptoren sind unter anderem essentiell für die Differenzierung und Knochenbildung während der Entwicklung
  • Die Studie legt nahe, dass die gefundene Mutation R206H zu einem überaktivierten ALK2-Rezeptor führt
  • Der BMP-Signalweg ist in den beiden nächsten Abbildungen dargestellt


Signalweg-2

signalweg


fop-6

Die GS-Domäne von ALK2

  • Die GS-Domäne ist ein strukturell definiertes Element im intrazellulären Teil von ALK2
  • Die GS-Domäne befindet sich zwischen dem Transmembransegment und der Kinase-Domäne
  • Die GS-Domäne interagiert mit verschiedenen intrazelulären Proteinen, welche das Signal des aktivierten Rezeptors an Signalkaskaden weitergeben
  • Interaktoren der GS-Domäne sind z.B. sogenannte Smad-Proteine und das Regulatorprotein FKBP12

 

Hypothesen zur Aktivierung von ALK2Picture7

  • Die gängige Hypothese ist eine “Hyperaktivierung” von ALK2 durch die Mutation
  • Eine andere Erklärung ist die verstärkte basale Aktivität des mutierten Rezeptors
  • Die Interaktionen des Rezeptors mit den Proteinen der intrazellulären Signalkaskade spielen eine wichtige Rolle
  • Der genaue Mechanismus ist aber unklar

Einführung FOP

Einführung in Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP, Münchmeyer-Syndrom)

Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP, Münchmeyer-Syndrom)

  • Erstmals in England um 1740 erwähnt
  • FOP ist eine enorm seltene Krankheit (ein sogennantes “Orphan Disease”), mit ca. einem Patienten pro 2 Millionen Menschen
  • Weltweit geht man von mehreren tausend Fällen aus, es sind aber nur ca. 600 Fälle dokumentiert
  • Damit zählt FOP zu den seltensten Krankheiten weltweit
  • FOP ist autosomal-dominant vererbbar, da aber FOP-Kranke beinahe nie Kinder bekommen, führt dies zu einer niedrigen Ausbreitung
  • Die durchschnittliche Lebenserwartung beträgt etwa 45 Jahre

Krankheitsverlauf

füsse

Der einzige Indikator für FOP bei Neugeborenen ist eine Fehlstellung der grossen Zehen:

  • In den ersten Jahren der Entwicklung erfahren die Patienten immer wieder heftige Entzündungsschübe
  • Das entzündete Gewebe heilt nicht mehr ab, sondern differenziert in Knochen
  • Die Differenzierung von entzündetem Gewebe in Knochenmaterial führt zu einer schleichenden Verknöcherung
  • Nach und nach bildet der Patient ein “zweites Skelett” aus:

rücken

Dies führt zu einer drastischen Einschränkung der Mobilität, der Tod tritt meist durch stark verminderte Lungenfunktion ein

Behandlung

  • Zur Zeit existiert keine effektive Therapie
  • Meist werden Entzündungshemmer eingesetzt, allerdings mit mässigem Erfolg
  • Die Krankheit kann daher momentan nur zu einem gewissen Grad kontrolliert, aber nicht geheilt werden