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Analyse mittles LRC BMP4

Analyse der Interaktionen des BMP4-Liganden mittels LRC Vorgehen Die Ligand-Receptor Capture (LRC) Technologie erlaubt es, für einen bestimmten Liganden das Spektrum an Zelloberflächenrezeptoren, mit welchen er interagiert, zu bestimmen Zu diesem Zweck wird der Ligand mit einem speziellen Crosslinker modifiziert und dann mit Zielzellen inkubiert, welche die Rezeptoren exprimieren Bindet der Ligand an einen bestimmten…

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Analyse U2OS-Zellen

Analyse des BMP-Signalwegs in U2OS-Zellen Vorgehen Um den BMP-Signalweg in U2OS-Zellen zu charakterisieren, wurden Pulldown-Versuche mit dem BMP-Rezeptor ALK2 durchgeführt Zunächst wurden wiederum die Aufreinigungsbedingungen für ALK2 wild-type und die ALK2 R206H-Mutanten aus U2OS optimiert Aufreinigungen im Pilotmassstab wurden zuerst mittels Western Blotting analysiert, um die Mengen an aufgereinigtem Zielprotein abschätzen zu können Pilotversuch mit…

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Resultate mit CaptiVate

Untersuchung des BMP-Signalwegs in HEK293-Zellen Folgende relevante Proteine wurden für die Analyse ausgewählt, da sie Schlüsselkomponenten in der frühen Signalkaskade von BMP darstellen: ALK2 wildtype receptor ALK2 mutated receptors: R206H (causes FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva)) Q207D (constitutive active) K235R (dominant negative) ALK6 wildtype receptor ALK6 mutated receptor (I200K): causes brachydactyl (shortness of the fingers and…

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Diskussion

Bedeutung der gefundenen Interaktoren von ALK2 Diskussion: das intrazelluläre Netzwerk von ALK2 Das Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte Dies…

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Resultate Zellmodellen

Testen von komplexeren Zellmodellen In einem nächsten Schritt wurde ein Zellmodell gesucht, welches physiologisch noch näher bei der in vivo-Situation von FOP liegt. Zu diesem Zweck wurden 3 verschiedene Zellmodelle getestet: HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) U2OS (human osteosarcoma cells) Jurkat (immortalized T lymphocytes) Alle 3 Modelle sind relevant für die entzündlichen Reaktionen und…

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Etablierung

Etablierung der optimierten Crosslinking-Methode Neben dem optimierten Aufreinigungsprotokoll wurde versucht, eine neue Methode zur Aufreinigung zu etablieren Bei dieser Methode werden die Proteinkomplexe zunächst in situ verbunden (Cross-linking), um schwache und transiente Interaktionen sichtbar machen zu können Mit Ausnahme des Cross-Linking-Schrittes, welcher am Anfang des Aufreinigungsprotokolls steht, fand die Aufreinigung analog zu dem vorhergehenden Protokoll…

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Untersuchung mit CaptiVate

Untersuchung des BMP-Signalweges mittels CaptiVate CaptiVate Aufreinigungsverfahren zur Analyse des Signalwegs CaptiVate™ Plattform: Beschreibung des Workflows Verwendung des Flp-In-Systems zur stabilen Expression Induzierbarer Promoter erlaubt regulierbare Expression  Teil I: Erstellung der stabilen Zelllinie Verwendung des Flp-In-Systems zur stabilen Expression Induzierbarer Promoter erlaubt regulierbare Expression     Teil II: Affinitätsreinigung des „Bait“-Komplexes Teil III: LC-MS/M-Analyse, bioinformatische…

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Offene Fragen

Offene Fragen im Zusammenhang mit dem molekularen Mechanismus Trotz der Identifikation des mutierten ALK2-Rezeptors als wahrscheinlicher Grund für FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) bestehen verschiedene offene Fragen im Bezug auf den Mechanismus der Fehlaktivierung: Wie verändert sich die Interaktion der mutierten GS-Domäne mit anderen Proteinen? Welche Komponenten der Signalkaskade sind davon betroffen? Können diese Interaktionen in…

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Krankheitsmechanismus

Erste Belege für eine Rolle des BMP-Signalwegs in FOP 2006 konnte durch eine sogennante “Genome Linkage Analysis” an FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva)-betroffenen Familien gezeigt werden, dass eine Punktmutation in einem Zelloberflächenrezeptor bei FOP eine Rolle spielt (Shore et al., 2006) Der identifizierte Zelloberflächenrezeptor, ACVR1/ALK2, gehört zur Familie der Typ I Bone Morphogenetic Protein (BMP) Rezeptoren…

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Einführung FOP

Einführung in Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP, Münchmeyer-Syndrom) Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP, Münchmeyer-Syndrom) Erstmals in England um 1740 erwähnt FOP ist eine enorm seltene Krankheit (ein sogennantes “Orphan Disease”), mit ca. einem Patienten pro 2 Millionen Menschen Weltweit geht man von mehreren tausend Fällen aus, es sind aber nur ca. 600 Fälle dokumentiert Damit zählt FOP…