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Analyse U2OS-Zellen

Analyse des BMP-Signalwegs in U2OS-Zellen

Vorgehen

  • Um den BMP-Signalweg in U2OS-Zellen zu charakterisieren, wurden Pulldown-Versuche mit dem BMP-Rezeptor ALK2 durchgeführt
  • Zunächst wurden wiederum die Aufreinigungsbedingungen für ALK2 wild-type und die ALK2 R206H-Mutanten aus U2OS optimiert
  • Aufreinigungen im Pilotmassstab wurden zuerst mittels Western Blotting analysiert, um die Mengen an aufgereinigtem Zielprotein abschätzen zu können
  • Pilotversuch mit ALK2 wild-type aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
  • Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

 

zellen U2OS

  • Pilotversuch mit ALK2 R206H aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
  • Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

zellen U2OS-69 zellen U2OS-68png

  • Zusätzlich wurde nochmals die Aktivität des Signalwegs in U2OS nach Stimulation mit BMP4 gemessen
  • Dabei wurde neben dem Marker p-Smad ein weiterer Marker, p-p38, untersucht

 

zellen U2OS-69

Aufreinigung und Identifikation der Proteinkomplexe aus U2OS

  • Sodann wurden eine Reihe von vollständigen Aufreinigungen des Signalkomplexes in U2OS durchgeführt, ausgehend von ALK2 wild-type und ALK2 R206H
  • Hierzu wurde das optimierte CaptiVate Pulldown/MS-Verfahrens eingesetzt
  • Aufreinigungen wurden im Triplikat durchgeführt
  • Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
  • Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
  • Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Aufreinigung und Analyse von ALK2 wild-type aus U2OS

  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

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Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 wild-type

  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

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  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

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  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

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  • Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 R206H
  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

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  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

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Resultate

  • Der kombinerte Datensatz aller ALK2 wild-type Aufreinigungen ergab sieben Interaktionspartner, welche gegenüber der Kontrolle signifikant waren
  • Der kombinerte Datensatz aller ALK2 R206H Aufreinigungen hingegen zeigte nur einen signifikanten Interaktionspartner
  • Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der mutierte Rezeptor in U2OS-Zellen weniger Interaktionen mit intrazellulären Proteinen eingeht, als der wild-type Rezeptor

Aufreinigung der Proteinkomplexe aus U2OS nach BMP4-Stimulation

  • Die Aufreinigung der beiden ALK2-Rezeptoren wurde auch nach Stimulation der U2OS-Zellen mit BMP4 durchgeführt
  • Dies sollte zeigen, ob sich die Interaktionsmuster der beiden Rezeptoren nach Stimulation mit BMP4 signifikant verändern
  • Aufreinigungen wurden ebenfalls im Triplikat durchgeführt
  • Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
  • Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
  • Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Aufreinigung und Analyse von ALK2 wild-type aus stimulierten U2OS

  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

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  • Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 wild-type
  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

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  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche nach Stimulation signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

 

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  • Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
  • Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

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  • Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 R206H
  • Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
  • Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
  • Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

 

aufreinigung 83

  • Volcano-Plot des finalen Datensatzes
  • Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
  • Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

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Aufreinigung der Proteinkomplexe aus  stimuliertenU2OS

Resultate

  • Für ALK2 wild-type zeigt die Stimulation mit BMP4 einen starken Effekt: nach BMP4-Behandlung wurden 15 Interaktoren gefunden
  • Die Aktivierung mit BMP4 führt also zu einer Interaktion des ALK2-Rezeptors mit 9 neuen Proteinen
  • Eine Interaktion geht durch die Stimulation verloren
  • Demgegenüber zeigt die ALK2 R206H Mutante erstaunlicherweise keine Veränderung im Interaktionsmuster: auch nach Stimulation konnte nur ein Interaktionspartner identifiziert werden
  • Dieser war mit der unstimulierten Probe identisch

Vergleich der Interaktionsdaten

Die vier finalen Datensätze werden in der untenstehenden Tabelle verglichen:

vergleich 86

In U2OS identifizierte Interaktionsnetzwerke

u2os87 U2OS-87

  • Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und R206H Rezeptoren in U2OS-Zellen, dargestellt mittels Cytoscape-Software
  • Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten

Zusammenfassung: ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen

  • Das ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
  • Bei den gefunden Interaktoren handelt es sich um Chaperone (Hilfsproteine bei der Faltung), Komponenten des Ubiquitinierungsweges (involviert in Proteindegradation) und Komponenten des ERAD-Signalweges (Rezeptor-Sorting und Abbau)
  • Nach Stimulation mit BMP4 nimmt die Interaktion mit regulierenden Proteinen zu, mehrere zusätzliche Chaperone und Ubiquitin-Ligasen wurden identifiziert
  • Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
  • Die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierte R206H-Mutante hingegen interagiert nicht mit für die Degradation relevanten Proteinen
  • Das Fehlen von in die Degradation involvierten Interaktoren bei der R206H-Mutante könnte bedeuten, dass diese stabiler als ALK2 wildtype ist und nach Stimulation mit BMP4 länger an der Zelloberfläche bleibt

Diskussion

Bedeutung der gefundenen Interaktoren von ALK2

diskussion103

Diskussion: das intrazelluläre Netzwerk von ALK2

  • Das Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
  • Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
  • Dies wird auch durch die Beobachtung unterstützt, dass nach Stimulation mit BMP4 mehrere in die Degradation involvierte Proteine an ALK2 binden, welche nicht an dem unstimulierten Rezeptor gefunden wurden
  • Dem gegenüber zeigt die bei FOP involvierte R206H-Mutante ein stark reduziertes Interaktionsspektrum, es wurden keine in die Degradation involvierten Interaktoren identifiziert
  • Möglicherweise interagiert die R206H-Mutante nur noch schwach mit den Proteinen der Degradationsmaschinerie, was wiederum Auswirkungen auf die Menge an ALK2-Rezeptor und dessen Präsenz an der Zelloberfläche haben könnte
  • Sollte die ALK2-Mutante an der Zelloberfläche akkumulieren, so könnte dies eine Rolle bei der in FOP beobachteten Überaktivität von ALK2 spielen

diskussion105

 

 

fop-106

FOP-Projekt: Erkenntnisse und Publikation der Daten

  • Das Projekt, die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Signalwege und Interaktionsnetzwerke zu untersuchen, wurde erfolgreich abgeschlossen
  • Dabei wurden Hinweise auf einen möglichen Krankheitsmechanismus gefunden, welcher zur Akkumulation des mutierten ALK2-Rezeptors an der Oberfläche der Zellen führen könnte
  • Dies könnte neue Ansätze zur Manipulation der Krankheit ergeben, in dem Faktoren gesucht werden, welche diese Akkumulation unterbinden könnten
  • Die experimentellen Daten werden nun vollständig interessierten Forschern zur Verfügung gestellt
  • Dies geschieht über direkten Kontakt zu relevanten Gruppen (z.B. Gruppe Kaplan) und Publikation auf der Website oder in Fachjournalen

Untersuchung mit CaptiVate

Untersuchung des BMP-Signalweges mittels CaptiVate

CaptiVate Aufreinigungsverfahren zur Analyse des Signalwegs

CaptiVate™ Plattform: Beschreibung des Workflows

Picture12

  • Verwendung des Flp-In-Systems zur stabilen Expression
  • Induzierbarer Promoter erlaubt regulierbare Expression

 Teil I: Erstellung der stabilen Zelllinie

  • Verwendung des Flp-In-Systems zur stabilen Expression
  • Induzierbarer Promoter erlaubt regulierbare Expression

 

Zelllinie

 

Teil II: Affinitätsreinigung des „Bait“-Komplexes

komplex

Teil III: LC-MS/M-Analyse, bioinformatische Auswertung

auswertung

 

CaptiVate™ Plattform: Vorteile

vorteile

 

  • Physiologisch: Expression der “Bait” von einem integrierten Transgen erlaubt physiologische Expressionsmengen
  • Reproduzierbar: alle Aufreinigungen werden im Triplikat durchgeführt (85% Reproduzierbarkeit)
  • Sensitiv: es werden nur 3×106 Zellen pro Aufreinigung benötigt
  • Spezifisch: bioinformatische Nachbearbeitung entfernt unspezifischen Hintergrund