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Analyse des BMP-Signalwegs in U2OS-Zellen

Vorgehen

• Um den BMP-Signalweg in U2OS-Zellen zu charakterisieren, wurden Pulldown-Versuche mit dem BMP-Rezeptor ALK2 durchgeführt
• Zunächst wurden wiederum die Aufreinigungsbedingungen für ALK2 wild-type und die ALK2 R206H-Mutanten aus U2OS optimiert
• Aufreinigungen im Pilotmassstab wurden zuerst mittels Western Blotting analysiert, um die Mengen an aufgereinigtem Zielprotein abschätzen zu können

• Pilotversuch mit ALK2 wild-type aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
• Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

 

• Pilotversuch mit ALK2 R206H aus unstimulierten und BMP4-stimulierten U2OS-Zellen
• Optimierte Aufreinigung des Proteinkomplexes und Detektion des gereinigten Zielproteins

• Zusätzlich wurde nochmals die Aktivität des Signalwegs in U2OS nach Stimulation mit BMP4 gemessen
• Dabei wurde neben dem Marker p-Smad ein weiterer Marker, p-p38, untersucht

 

Aufreinigung und Identifikation der Proteinkomplexe aus U2OS

• Sodann wurden eine Reihe von vollständigen Aufreinigungen des Signalkomplexes in U2OS durchgeführt, ausgehend von ALK2 wild-type und ALK2 R206H
• Hierzu wurde das optimierte CaptiVate Pulldown/MS-Verfahrens eingesetzt
• Aufreinigungen wurden im Triplikat durchgeführt
• Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
• Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
• Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Aufreinigung und Analyse von ALK2 wild-type aus U2OS

• Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
• Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 wild-type

• Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
• Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
• Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

• Volcano-Plot des finalen Datensatzes
• Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
• Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

• Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
• Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

 

• Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 R206H
• Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
• Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
• Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

• Volcano-Plot des finalen Datensatzes
• Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
• Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

Resultate

• Der kombinerte Datensatz aller ALK2 wild-type Aufreinigungen ergab sieben Interaktionspartner, welche gegenüber der Kontrolle signifikant waren
• Der kombinerte Datensatz aller ALK2 R206H Aufreinigungen hingegen zeigte nur einen signifikanten Interaktionspartner
• Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der mutierte Rezeptor in U2OS-Zellen weniger Interaktionen mit intrazellulären Proteinen eingeht, als der wild-type Rezeptor

Aufreinigung der Proteinkomplexe aus U2OS nach BMP4-Stimulation

• Die Aufreinigung der beiden ALK2-Rezeptoren wurde auch nach Stimulation der U2OS-Zellen mit BMP4 durchgeführt
• Dies sollte zeigen, ob sich die Interaktionsmuster der beiden Rezeptoren nach Stimulation mit BMP4 signifikant verändern
• Aufreinigungen wurden ebenfalls im Triplikat durchgeführt
• Die aufgereinigten Proben wurden für die Massenspektrometrie vorbereitet, durch Nano-LC aufgetrennt und in der LTQ Orbitrap analysiert
• Die Datensätze wurden mittels verschiedenen bioinformatischen Methoden aufbereitet und analysiert
• Die verschiedenen Datensätze wurden gefiltert und dann in einen Datensatz kombiniert (finaler Datensatz)

Aufreinigung und Analyse von ALK2 wild-type aus stimulierten U2OS

• Scatterplots verschiedener Aufreinigungen gegen Kontrollen
• Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

• Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 wild-type
• Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
• Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
• Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

• Volcano-Plot des finalen Datensatzes
• Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 wild-type und die Kontrolle
• Signalproteine, welche nach Stimulation signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

 

• Scatterplots verschiedener Aufreinigungen von ALK2 R206H gegen Kontrollen
• Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Experimente liegt innerhalb der vorgegebenen Parameter

• Erste bioinformatische Analyse des kombinierten Datensatzes für ALK2 R206H
• Daten aus 3 unabhängigen Experimenten sind dargestellt
• Jedes Experiment wurde gegen ein Kontrollexperiment (control) gefahren
• Der Plot zeigt die relative Abundanz der gefundenen Komplexpartner

 

• Volcano-Plot des finalen Datensatzes
• Der Plot zeigt die identifizierten Komplexpartner für ALK2 R206H und die Kontrolle
• Signalproteine, welche signifikant häufiger im ALK2-Komplex vorkommen, sind hervorgehoben

 

Aufreinigung der Proteinkomplexe aus  stimuliertenU2OS

Resultate

• Für ALK2 wild-type zeigt die Stimulation mit BMP4 einen starken Effekt: nach BMP4-Behandlung wurden 15 Interaktoren gefunden
• Die Aktivierung mit BMP4 führt also zu einer Interaktion des ALK2-Rezeptors mit 9 neuen Proteinen
• Eine Interaktion geht durch die Stimulation verloren
• Demgegenüber zeigt die ALK2 R206H Mutante erstaunlicherweise keine Veränderung im Interaktionsmuster: auch nach Stimulation konnte nur ein Interaktionspartner identifiziert werden
• Dieser war mit der unstimulierten Probe identisch

Vergleich der Interaktionsdaten

Die vier finalen Datensätze werden in der untenstehenden Tabelle verglichen:

In U2OS identifizierte Interaktionsnetzwerke

• Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und R206H Rezeptoren in U2OS-Zellen, dargestellt mittels Cytoscape-Software
• Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten

Zusammenfassung: ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen

• Das ALK2-Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
• Bei den gefunden Interaktoren handelt es sich um Chaperone (Hilfsproteine bei der Faltung), Komponenten des Ubiquitinierungsweges (involviert in Proteindegradation) und Komponenten des ERAD-Signalweges (Rezeptor-Sorting und Abbau)
• Nach Stimulation mit BMP4 nimmt die Interaktion mit regulierenden Proteinen zu, mehrere zusätzliche Chaperone und Ubiquitin-Ligasen wurden identifiziert
• Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
• Die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierte R206H-Mutante hingegen interagiert nicht mit für die Degradation relevanten Proteinen
• Das Fehlen von in die Degradation involvierten Interaktoren bei der R206H-Mutante könnte bedeuten, dass diese stabiler als ALK2 wildtype ist und nach Stimulation mit BMP4 länger an der Zelloberfläche bleibt

Bedeutung der gefundenen Interaktoren von ALK2

Diskussion: das intrazelluläre Netzwerk von ALK2

• Das Interaktionsnetzwerk in U2OS-Zellen zeigt eine grosse Zahl regulatorischer Proteine, welche die Verteilung und den Abbau des Rezeptors innerhalb der Zellen regulieren
• Dies weist darauf hin, dass der ALK2-Rezeptor stark reguliert ist und nach Stimulation mit BMP4 internalisiert und degradiert werden könnte
• Dies wird auch durch die Beobachtung unterstützt, dass nach Stimulation mit BMP4 mehrere in die Degradation involvierte Proteine an ALK2 binden, welche nicht an dem unstimulierten Rezeptor gefunden wurden
• Dem gegenüber zeigt die bei FOP involvierte R206H-Mutante ein stark reduziertes Interaktionsspektrum, es wurden keine in die Degradation involvierten Interaktoren identifiziert
• Möglicherweise interagiert die R206H-Mutante nur noch schwach mit den Proteinen der Degradationsmaschinerie, was wiederum Auswirkungen auf die Menge an ALK2-Rezeptor und dessen Präsenz an der Zelloberfläche haben könnte
• Sollte die ALK2-Mutante an der Zelloberfläche akkumulieren, so könnte dies eine Rolle bei der in FOP beobachteten Überaktivität von ALK2 spielen

 

 

FOP-Projekt: Erkenntnisse und Publikation der Daten

• Das Projekt, die bei FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Signalwege und Interaktionsnetzwerke zu untersuchen, wurde erfolgreich abgeschlossen
• Dabei wurden Hinweise auf einen möglichen Krankheitsmechanismus gefunden, welcher zur Akkumulation des mutierten ALK2-Rezeptors an der Oberfläche der Zellen führen könnte
• Dies könnte neue Ansätze zur Manipulation der Krankheit ergeben, in dem Faktoren gesucht werden, welche diese Akkumulation unterbinden könnten
• Die experimentellen Daten werden nun vollständig interessierten Forschern zur Verfügung gestellt
• Dies geschieht über direkten Kontakt zu relevanten Gruppen (z.B. Gruppe Kaplan) und Publikation auf der Website oder in Fachjournalen