Etablierung der optimierten Crosslinking-Methode

  • Neben dem optimierten Aufreinigungsprotokoll wurde versucht, eine neue Methode zur Aufreinigung zu etablieren
  • Bei dieser Methode werden die Proteinkomplexe zunächst in situ verbunden (Cross-linking), um schwache und transiente Interaktionen sichtbar machen zu können
  • Mit Ausnahme des Cross-Linking-Schrittes, welcher am Anfang des Aufreinigungsprotokolls steht, fand die Aufreinigung analog zu dem vorhergehenden Protokoll statt

Etablierung 46

Die Verwendung des Cross-Linking ergab eine leicht erhöhten Sensitivität bei den Pulldowns
Dennoch wurde die Methode nicht weiterentwickelt, da die Reproduzierbarkeit nicht genügend war

Zusammenfassung: Etablierung der Methode in HEK293 Zellen

  • Es wurden 8 Schlüsselproteine aus dem BMP-Signalweg ausgesucht, welche für den Krankheitsmechanismus von FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) relevant sein könnten
  • Die entsprechenden 8 Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und in HEK293 Zellen integriert, um stabile Linien zu erzeugen, welche die Schlüsselproteine exprimieren
  • Verschiedene Aufreinigungsmethoden wurden getestet und optimiert
  • Aufreinigungen wurden mittels der optimierten Methode durchgeführt
  • Die erhaltenen Daten wurden mittels Bioinformatik-Methoden analysiert

In HEK293 identifizierte Interaktionsnetzwerke

HEK293 49

  • Interaktionsnetzwerk der ALK2 wildtype und Q207DRezeptoren, dargestellt mittels Cytoscape-Software
  • Dargestellt sind sowohl experimentell gefundene Interaktionen, also auch Literaturdaten
  • In der nächsten Abbildung ist das Interaktionsnetzwerk kommentier

 

interaktion50