Analyse der Interaktionen des BMP4-Liganden mittels LRC

Vorgehen

  • Die Ligand-Receptor Capture (LRC) Technologie erlaubt es, für einen bestimmten Liganden das Spektrum an Zelloberflächenrezeptoren, mit welchen er interagiert, zu bestimmen
  • Zu diesem Zweck wird der Ligand mit einem speziellen Crosslinker modifiziert und dann mit Zielzellen inkubiert, welche die Rezeptoren exprimieren
  • Bindet der Ligand an einen bestimmten Rezeptor, so stabilisiert der Crosslinker diese Interaktion und erlaubt die Identifikation des Rezeptors mittels Massenspektrometrie
  • Dieses Verfahren wurde auf den in FOP (Fibrodysplasia ossificans progressiva) involvierten Liganden BMP4 angewendet, um Zielrezeptoren auf HEK293 Zellen zu identifizieren

Kontrollexperiment zur Aktivitätsbestimmung von BMP4-TriCEPS

  • BMP4-Ligand wurde an den TriCEPS Crosslinker gekoppelt
  • Um zu bestimmen, ob BMP4-TriCEPS detektierbar ist, wurde dieses mittels einer Dot Blot Methode getestet
  • Als Kontrolle diente ein Standard-Ligand, Insulin-TriCEPS
  • Wie unten sichtbar, kann BMP4-TriCEPS detektiert werden und ist somit funktionell

 

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  • Clusteranalyse der LRC-Datensätze
  • Die Datensätze aus dem LRC-Experiment wurden gefiltert und verarbeitet
  • Das Cluster-Diagramm zeigt BMP4-Daten im Triplikat gegen eine negative Kontrolle

 

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Volcano-Plot der identifizierten Rezeptoren

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Resultate

  • Es wurden 7 Rezeptoren identifiziert, welche spezifisch mit BMP4 interagieren
  • Der ALK2-Rezeptor wurde nicht identifiziert
  • Vier der identifizierten Rezeptoren sind in einem funktionellen Netzwerk zu finden, welches die Degradation von Rezeptoren reguliert:
  •      Lysosome membrane protein 2 (SCRB2)
  •      Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1)
  •      Endoplasmin (ENPL)
  •      HYOU1
  • Möglicherweise wurde der ALK2-Rezeptor nicht gefunden, da er nach seiner Aktivierung durch BMP4-Bindung sehr schnell von diesem oder ähnlichen Degradationskomplexen von der Zelloberfläche entfernt und degradiert wird